| Sažetak | Ciljevi istraživanja: ispitati izražaj tirozin kinaznih receptora i ciklina D1 u rutinskom, nasumce odabranim uzorcima, 135 primarnih karcinoma debelog crijeva. Od tirozin kinaznih receptora cilj je bio najprije imunohistokemijski ispitati membranski (mEGFR) i nuklearni (nEGFR) izražaj EGFR te izražaj Her-2, c-kit proteina a potom utvrditi njihovu međusobnu udruženost kao i udruženost s ciklinom D1. Osim proteinskog izražaja cilj je bio ispitati i gensku amplifikaciju EGFR i Her-2 te ju usporediti s proteinskim izražajem navedenih markera. Konačno, cilj je bio usporediti proteinski izražaj i genski status navedenih receptora s prognostičkim parametrima, histološkim stupnjem diferencijacije i stadijem proširenosti bolesti (Dukes klasifikacija). Materijali i metode: imunohistokemijski je obrađeno 135 uzoraka tkiva arhivskog materijala adenokarcinoma različitih lokalizacija tako što se mEGFR, i c-kit izražajnost analizirala na potpunim rezovima, a nEGFR, Her2 i ciklin D1 izražaj na tkivnim mikroarejima. Procjena imunoreaktivnosti navedenih markera utvrđena je prema intenzitetu obojenosti i postotku pozitivnih tumorskih stanica. Florescentnom in situ hibridizacijom analiziran je genski status za EGFR i Her2 (Vysis, Downers Grove, IL, SAD). Stanice s normalnim brojem kromosoma 7 imale su dva narančasta i dva zelena signala po jezgri ili omjer ≤ 2.0 - 2.49, amplifikacija se definirala ako je taj omjer bio ≥ 2,94, odnosno polisomija, ako je bilo nađeno više od dva CEP7 signala po jezgri na više od 40% tumorskih stanica, ili ako je taj omjer bio između 2.5 – 2.93. Za analizu statusa HER2 gena određivao se omjer zbroja Her-2 signala i kontrolnih CEP17 signala na ukupno 20 jezgara tumorskih stanica. Amplifikacija se definirala kao omjer > 2,2, a amplifikacije Her-2 gena nije bilo ako je omjer < 1,8. Statistički podatci obrađivani su na osobnom računalu koristeći neparametrijski test (Spearman koeficjent korelacije rangova). VI Rezultati: imunohistokemijske analize utvrdili su snažan mEGFR izražaj u 22 (16.3%), odnosno snažan nEGFR izražaj u 77 (57%) kolorektalnih karcinoma. Izražaj mEGFR i nEGFR proteina nije bio međusobno povezan (p = 0.756). Izražaj Her-2 i c-kit proteina bio je u najvećem broju slučajeva kolorektalnih karcinoma negativan, odnosno u 128 (95%) za HER-2 i u nešto manjem broju 84 (62%) za c-kit dok je izražaj ciklina D1 u najvećem broju slučajeva bio snažno pozitivan, točnije u 76 odnosno u 56% slučajeva. Međusobnom udruženosti tirozin kinaznih receptora (EGFR, Her-2 i c-kit) nije uočena statistička značajnost, dok je usporedbom njihova izražaja i ciklina D1 utvrđena statistički značajna povezanost samo između nEGFR i ciklina D1 (p<0.001). Metodom FISH analize, u najvećem broju slučajeva nisu utvrđene abnormalnosti, odnosno EGFR amplifikacija potvrđena je u svega 8 (6%), odnosno Her-2 amplifikacija u 4 (3%) kolorektalnih karcinoma. Usporedbom imunhistokemijske i FISH analize utvrđena je statistički značajna udruženst jedino između snažne mEGFR izražajnosti i genske amplifikacije (p = 0.001). Usporedbom rezultata svih navedenih imunohistokemijskih i genskih biomarkera s kliničko-patološkim kriterijima u kolorektalnim karcinomima, jedino je utvrđena udruženost između umjerene izražajnosti mEGFR i tumorskog gradusa (p = 0.042), točnije slabije diferencirani adenokarcinomi karakterizirani su umjerenim izražajem mEGFR. Zaključci: rezultati studije potvrđuju heterogenost unutar skupine kolorektalnih karcinoma koja je udružena s postotkm, intezitetom i subcelularnom lokalizacijom proteinskog izražaja tirozin kinaznih receptora i ciklin D1 te različitim genskim statusom EGFR i HER-2. Uočena heterogenost vjerojanto je povezana s biološki, a moguće i klinički različitim podskupinama kolorektalnih karcinima koje će različito odgovoriti na anti-EGFR terapiju. Sukladno tomerezultati potiču daljnja istraživanja u cilju bolje spoznaje selekcije pacijenata za primjenu ciljane biološke terapije. |
| Sažetak (engleski) | Objectives: The aim of the present study was to analyse the expression of tyrosine kinase receptor and cyclin D1 in 135 primary, consecutively collected colorectal carcinomas. More specifically, the goal was explore immunohistochemically the expression of membranous (mEGFR), nuclear (nEGFR) EGFR, Her-2 and c-kit proteins and to correlate their values. In addition to protein expression and the aim was to examine the gene status of EGFR and Her-2 and to correlate their findings with protein expression of analyzed markers. Finally, the aim was to correlate the analysed protein expression and gene status with clinical-pathological parameters, such as histological grade of adenocarcinoma, and stage of disease (Dukes classification).Material and Methods: immunohistochemistry was processed on 135 archival formalin fixed and paraffin embedded material of colorectal adenocarcinomas with different localization. mEGFR and c-kit expression was analyzed on whole tissue sections, while nEGFR, Her-2 and cyclin D1 expression on tissue microarrays (TMA). Assessment of immunoreactivity was determinated by staining intensity and percentage of positive tumor cells. By fluorescent in situ hybridization (FISH) the EGFR and Her-2 gene status was analyzed (Vysis, Downers Grove, IL, USA). Cells with the normal number of chromosomes 7, had two orange and two green signals per nucleus, or the ratio of ≤ 2.0 – 2.49, amplification is defined when the ratio was ≥ 2.94, respectively polysomies if it was found more than two signals per nucleus CEP7 the more than 40% tumor cells, or that the ratio was between 2.5 - 2.93. For the analysis of Her-2 gene status was determined by the ratio of the sum of the Her-2 CEP17 signals and control signals to a total of 20 nuclei of tumor cells. Amplification is defined as a ratio> 2.2, and amplification Her-2 gene was not, if the ratio <1.8. Statistical data were processed on a PC using a nonparametric test (Spearman rank correlation coefficient). VIII |
