| Sažetak | Ciljevi istraživanja: ispitati izražaj tirozin kinaznih receptora i ciklina D1 u rutinskom,
nasumce odabranim uzorcima, 135 primarnih karcinoma debelog crijeva. Od tirozin kinaznih
receptora cilj je bio najprije imunohistokemijski ispitati membranski (mEGFR) i nuklearni
(nEGFR) izražaj EGFR te izražaj Her-2, c-kit proteina a potom utvrditi njihovu međusobnu
udruženost kao i udruženost s ciklinom D1. Osim proteinskog izražaja cilj je bio ispitati i
gensku amplifikaciju EGFR i Her-2 te ju usporediti s proteinskim izražajem navedenih
markera. Konačno, cilj je bio usporediti proteinski izražaj i genski status navedenih receptora
s prognostičkim parametrima, histološkim stupnjem diferencijacije i stadijem proširenosti
bolesti (Dukes klasifikacija).
Materijali i metode: imunohistokemijski je obrađeno 135 uzoraka tkiva arhivskog materijala
adenokarcinoma različitih lokalizacija tako što se mEGFR, i c-kit izražajnost analizirala na
potpunim rezovima, a nEGFR, Her2 i ciklin D1 izražaj na tkivnim mikroarejima. Procjena
imunoreaktivnosti navedenih markera utvrđena je prema intenzitetu obojenosti i postotku
pozitivnih tumorskih stanica. Florescentnom in situ hibridizacijom analiziran je genski status
za EGFR i Her2 (Vysis, Downers Grove, IL, SAD). Stanice s normalnim brojem kromosoma
7 imale su dva narančasta i dva zelena signala po jezgri ili omjer ≤ 2.0 - 2.49, amplifikacija se
definirala ako je taj omjer bio ≥ 2,94, odnosno polisomija, ako je bilo nađeno više od dva
CEP7 signala po jezgri na više od 40% tumorskih stanica, ili ako je taj omjer bio između 2.5 –
2.93. Za analizu statusa HER2 gena određivao se omjer zbroja Her-2 signala i kontrolnih
CEP17 signala na ukupno 20 jezgara tumorskih stanica. Amplifikacija se definirala kao omjer
> 2,2, a amplifikacije Her-2 gena nije bilo ako je omjer < 1,8. Statistički podatci obrađivani su
na osobnom računalu koristeći neparametrijski test (Spearman koeficjent korelacije rangova).
VI
Rezultati: imunohistokemijske analize utvrdili su snažan mEGFR izražaj u 22 (16.3%),
odnosno snažan nEGFR izražaj u 77 (57%) kolorektalnih karcinoma. Izražaj mEGFR i
nEGFR proteina nije bio međusobno povezan (p = 0.756). Izražaj Her-2 i c-kit proteina bio je
u najvećem broju slučajeva kolorektalnih karcinoma negativan, odnosno u 128 (95%) za
HER-2 i u nešto manjem broju 84 (62%) za c-kit dok je izražaj ciklina D1 u najvećem broju
slučajeva bio snažno pozitivan, točnije u 76 odnosno u 56% slučajeva. Međusobnom
udruženosti tirozin kinaznih receptora (EGFR, Her-2 i c-kit) nije uočena statistička
značajnost, dok je usporedbom njihova izražaja i ciklina D1 utvrđena statistički značajna
povezanost samo između nEGFR i ciklina D1 (p<0.001). Metodom FISH analize, u najvećem
broju slučajeva nisu utvrđene abnormalnosti, odnosno EGFR amplifikacija potvrđena je u
svega 8 (6%), odnosno Her-2 amplifikacija u 4 (3%) kolorektalnih karcinoma. Usporedbom
imunhistokemijske i FISH analize utvrđena je statistički značajna udruženst jedino između
snažne mEGFR izražajnosti i genske amplifikacije (p = 0.001). Usporedbom rezultata svih
navedenih imunohistokemijskih i genskih biomarkera s kliničko-patološkim kriterijima u
kolorektalnim karcinomima, jedino je utvrđena udruženost između umjerene izražajnosti
mEGFR i tumorskog gradusa (p = 0.042), točnije slabije diferencirani adenokarcinomi
karakterizirani su umjerenim izražajem mEGFR.
Zaključci: rezultati studije potvrđuju heterogenost unutar skupine kolorektalnih karcinoma
koja je udružena s postotkm, intezitetom i subcelularnom lokalizacijom proteinskog izražaja
tirozin kinaznih receptora i ciklin D1 te različitim genskim statusom EGFR i HER-2. Uočena
heterogenost vjerojanto je povezana s biološki, a moguće i klinički različitim podskupinama
kolorektalnih karcinima koje će različito odgovoriti na anti-EGFR terapiju. Sukladno tome
rezultati potiču daljnja istraživanja u cilju bolje spoznaje selekcije pacijenata za primjenu
ciljane biološke terapije.
Ključne riječi: kolorektalni karcinom, nuklearni EGFR, Her2, ciklin D1, c-kit, FISH. |
| Sažetak (engleski) | Objectives: The aim of the present study was to analyse the expression of tyrosine kinase
receptor and cyclin D1 in 135 primary, consecutively collected colorectal carcinomas. More
specifically, the goal was explore immunohistochemically the expression of membranous
(mEGFR), nuclear (nEGFR) EGFR, Her-2 and c-kit proteins and to correlate their values. In
addition to protein expression and the aim was to examine the gene status of EGFR and Her-2
and to correlate their findings with protein expression of analyzed markers. Finally, the aim
was to correlate the analysed protein expression and gene status with clinical-pathological
parameters, such as histological grade of adenocarcinoma, and stage of disease (Dukes
classification).
Material and Methods: immunohistochemistry was processed on 135 archival formalin fixed
and paraffin embedded material of colorectal adenocarcinomas with different localization.
mEGFR and c-kit expression was analyzed on whole tissue sections, while nEGFR, Her-2 and
cyclin D1 expression on tissue microarrays (TMA). Assessment of immunoreactivity was
determinated by staining intensity and percentage of positive tumor cells. By fluorescent in
situ hybridization (FISH) the EGFR and Her-2 gene status was analyzed (Vysis, Downers
Grove, IL, USA). Cells with the normal number of chromosomes 7, had two orange and two
green signals per nucleus, or the ratio of ≤ 2.0 – 2.49, amplification is defined when the ratio
was ≥ 2.94, respectively polysomies if it was found more than two signals per nucleus CEP7
the more than 40% tumor cells, or that the ratio was between 2.5 - 2.93. For the analysis of
Her-2 gene status was determined by the ratio of the sum of the Her-2 CEP17 signals and
control signals to a total of 20 nuclei of tumor cells. Amplification is defined as a ratio> 2.2,
and amplification Her-2 gene was not, if the ratio <1.8. Statistical data were processed on a
PC using a nonparametric test (Spearman rank correlation coefficient).
VIII
Results: immunohistochemically, strong mEGFR and strong nEGFR staining was detected 22
(16.3%), and 77 (57%) colorectal cancer. Expression and mEGFR nEGFR protein was not
associated (p = 0.756). Expression of Her-2 and c-kit protein was in most cases of colorectal
carcinoma negative, or more specifically, Her-2 was negative in 128 (95%), and c-kit in 84
(62%) cases, on the other hand cyclin D1 expression was found strong positive in the major
(56%) of cases. There was no association between tyrosine kinase receptors expression
(EGFR, Her-2 and c-kit), whereas nEGFR expression was strongly related to cyclin D1
expression (p <0.001). In mosta cases FISH analysis did not reveal any abnormalities. Gene
EGFR amplification was confirmed in only 8 (6%), and gene Her-2 amplification in 4 (3%)
colorectal carcinomas. Tumor cells displaying gene Her-2 amplification and strong protein
membrane EGFR expression overlapped (p = 0.001). Comparing immunohistochemical and
genetic biomarkers with clinical-pathological criteria a statistically significant difference was
only found between tumor grade and expression of mEGFR (p = 0.042) namely, poorly
differentiated adenocarcinomas were characterized by moderate expression mEGFR.
Conclusion: study results reveled heterogeneity among colorectal carcinomas concerning the
percentage, intensity and subcellular localization of tyrosine kinase receptors and cyclin D1
protein expression as well as gene EGFR and Her-2 status. The observed heterogeneity
probably is associated with biological and clinical different subgroups of colorectal
carcinomas with the possible diverse response to anti-EGFR therapy. Obtained results
encourage further investigation which would highlight better stratification of patients for
targeted biological therapies. |
