Title THE ROLE OF T-CELL RECEPTOR SIGNAL STRENGTH IN CONTROLLING CLONAL DIVERSITY OF CD8 T-CELL MEMORY Title (croatian) ULOGA JAKOSTI AKTIVIRAJUĆEG SIGNALA NA T STANIČNI RECEPTOR U KONTROLI KLONALNE RAZNOLIKOSTI IMUNOLOŠKE MEMORIJE POSREDOVANE CD8 LIMFOCITIMA T Author Inga Kavazović Mentor Felix Martinus Wensveen (mentor)Committee member Bojan Polić (predsjednik povjerenstva)Committee member Dora Višnjić (član povjerenstva)Committee member Igor Jurak (član povjerenstva)Committee member Felix Martinus Wensveen (član povjerenstva)Granter University of Rijeka Defense date and country 2020-03-20, Croatia Scientific / art field, BIOMEDICINE AND HEALTHCARE Universal decimal classificationUDC ) 61 - Medical sciences ThesaurusMESH - Medical Subject Headings )
Immunity
Infection
CD8-Positive T-Lymphocytes
Abstract Objectives: CD8 T cell-mediated immunity plays a critical role in the protection from intracellular pathogens and tumors. To recognize the large number of potential threats, the naïve CD8 T-cell pool consists of millions of clones, each one unique based on its T-cell receptor (TCR). Upon infection, only a few of these clones are recruited to generate antigen-specific memory. Selection of memory clones is a trade-off between specificity and diversity; too much specificity restricts antigen-recognition, which precludes responsiveness against pathogens with small mutations. Too much diversity impairs efficiency of recall responses. Mechanisms controlling memory diversity are largely unknown. The proposed research aims to identify key molecular mechanisms that regulate the clonal diversity of the memory CD8 T-cell pool.
Materials and Methods: To investigate how signal strength impacts memory differentiation, we set up an in vitro model in which we stimulated OT-1 T cells with SIINFEKL (N4 peptide) or altered peptide ligands (APLs). Using high-throughput transcriptome analysis, we identified potential master regulators of low-affinity memory formation (Eomes and Bcl-2). To confim these findings in vivo we used mCMV, LCMV or L. monocytogenes expressing N4 or APLs. To demonstrate a specific role for Eomes, we adoptively transferred cells from conditional knock-out mice (OT-1 Eomesfl/flCD4Cre; EomesCKO). Moreover, the inducible MXCre system was used to determine the timeframe in which Eomes mediates this pro-survival effect. To confirm this data in polyclonal system we generated mixed bone marrow chimeras (MBMCs) containing WT and EomesCKO cells. The chemical compound ABT-199 was used to specifically inhibit Bcl-2. To asses if Eomes binds to Bcl2 promoter region we performed Eomes ChIP-seq on activated OT-1 cells. To confirm that Eomes deficience results with reduced clonal diversity of memory CD8 T-cell pool we performed TCR sequencing of antigen-specific WT and EomesCKO memory CD8 T cells from MBMCs.
Results: We find that memory precursors stimulated within a window of cumulative signal intensity maximally induce the transcription factor Eomes. Eomes directly drives expression of the pro-survival protein Bcl-2, providing a survival advantage for cells of submaximal affinity. Beyond this window, T-bet expression dominates, which inhibits Eomes-induced transcription of Bcl-2. The increased proliferative potential of clones activated with a TCR ligand of high-affinity causes them to dominate the memory pool, whereas the survival advantage of cells of submaximal affinity ensures their persistence into memory, despite an environment of antigen affinity-based selection.
Conclusion: We demonstrate on a molecular level how sufficient diversity of the memory pool is established in an environment of affinity-based selection. These findings may be beneficial for the development of T cell-based vaccines with an increased scope
Abstract (croatian) Cilj istraživanja: Imunost posredovana CD8 limfocitima T igra ključnu ulogu u zaštiti od unutarstaničnih patogena i tumora. Da bi prepoznali veliki broj potencijalnih prijetnji, naivni CD8 limfociti T obuhvaćaju milijune različitih klonova, od kojih je svaki jedinstven na temelju T staničnog receptora. Nakon infekcije, samo nekolicina tih klonova ima sposobnost stvaranja dugoročne antigen-specifične imunološke memorije. Selekcija memorijskih klonova je bazirana na balansiranju specifičnosti i raznolikosti; prevelika specifičnost ograničava prepoznavanje antigena s mutacijama u imunodominantnim epitopima. Previše raznolikosti smanjuje učinkovitost specifičnog prepoznavanja. Mehanizmi koji kontroliraju raznolikost memorije još uvijek su nepoznati. Predloženo istraživanje ima za cilj identificirati ključne molekularne mehanizme koji reguliraju klonalnu raznolikost imunološke memorije posredovane CD8 limfocitima T.
Materijali i metode: Kako bi razjasnili utjecaj jakosti aktivirajućeg signala na T- stanični receptor u kontekstu formiranja imunološke memorije uspostavili smo in vitro model - OT-1 CD8 limfociti T su stimulirani sa SIINFEKL (N4) peptidom ili izmijenjenim peptidnim ligandima (eng. altered peptide ligands - APL) s nižim afinitetoma za T stanični receptor. Koristeći visokoprotočnu analizu transkriptoma identificirali smo potencijalne ključne faktore za razvoj memorijskih stanica niskog afiniteta (Eomes i Bcl-2). Kako bi dobivene rezultate potvrdili in vivo koristili smo modele infekcija s mCMV, LCMV ili L. monocytogenes koji ispoljavaju N4 peptid ili APL. S ciljem dokazivanja ključne uloge transkripcijskog faktora Eomes u dugoročnom preživljavanju memorijskih stanica niskog afiniteta proveli smo pokuse adoptivnog transfera Eomes-deficijentnih stanica (OT-1 Eomesfl/flCD4Cre; EomesCKO). Osim toga, inducibilni MXCre sustav korišten je za određivanje vremenskog okvira u kojem Eomes posreduje navedeni učinak. Kako bi smo potvrdili dobivene rezultate u poliklonalnom sustavu stvorili smo mješovite kimerične životinje koristeći stanice koštane srži miševa divljeg tipa (WT) i EomesCKO miševa, dok je spoj ABT-199 korišten za specifično inhibiranje molekule Bcl-2. U svrhu ispitivanja vezanja faktora Eomes na promotorsku regiju Bcl2 gena, proveli smo Eomes ChIP-seq analizu na aktiviranim OT-1 stanicama. S ciljem određivanja molekularnog mehanizma koji je odgovoran za prednost u preživljavanju memorijskih stanica niskog afiniteta, koristili smo transgenične NIH3T3 i HEK293 stanične linije koje ispoljavaju Eomes i/ili T-bet. Navedeno ispitivanje smo proveli pomoću luciferaznog reporter eseja upotrebom specifičnih plazmida. Da bismo potvrdili da nedostatak transkripcijskog faktora Eomes rezultira smanjenom klonalnom raznolikošću proveli smo TCR sekvencioniranje antigen-specifičnih WT i EomesCKO CD8 limfocita T izoliranih iz mješovitih kimeričnih životinja 30 dana nakon infekcije LCMV-om.
Rezultati: Stimulacija CD8 limfocita T submaksimalnim intenzitetom kumulativnog aktivirajućeg signala dovodi do najviše razine ispoljavanja transkripcijskog faktora Eomes. Eomes direktno na transkripcijskog razini potiče ispoljavanje Bcl-2 proteina što rezultira dugoročnim preživljavanjem memorijskih stanica submaksimalnog afiniteta. Ukoliko su stanice stimulirane jačim intenzitetom dolazi do dominacije transkripcijskog faktora T-bet koji inhibira Eomes-induciranu transkripciju Bcl-2. Povećani proliferativni potencijal klonova visokog afiniteta je odgovoran za njihovu dominaciju, dok prednost u preživljavanju stanica submaksimalnog afiniteta omogućuje njihovu perzistenciju u memorijskoj fazi imunološkog odgovora.
Zaključak: Ovaj rad otkriva molekularni mehanizam koji je temelj za uspostavljanje potrebne raznolikost klonova memorijskih CD8 limfocita T. Dobiveni rezultati mogu se koristiti u svrhu unaprjeđenja imunoterapije posredovane limfocitima T.
Keywords
CD8-Positive T-Lymphocytes
Immunity
Immunological Memory
Infection
Keywords (croatian)
CD8-pozitivni limfociti T
Imunitet
Imunološka memorija
Infekcija.
Language english URN:NBN urn:nbn:hr:184:558146 Promotion 2020 Study programme Title: Biomedicine Postgraduate (doctoral) study programme Type of resource Text File origin Born digital Access conditions Access restricted to students and staff of home institution Terms of use Repository Repository of the University of Rijeka, Faculty of Medicine Created on 2020-10-16 15:31:10
